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2001年1月14日，按酒署发（2001）7号文件批复，敦煌高等职业技术学院建设协调领导小组和筹建委员会成立，原酒泉地委副书记邢同义任领导小组组长，地委委员、行署常务副专员王殿映任副组长，地区教委副主任高岩杰任筹建委员会主任。
2001年2月，按酒署发（2001）37号（酒泉地区行政公署）、酒政发（2001）34号（酒泉市人民政府）批复精神，酒泉教育学院周边土地统一规划为 “敦煌学院”建设用地，具体界址为：肃州路以东，富康路以南，解放北路以西，敦煌路以北，面积约330亩。
2001年2月12日、20日、26日，甘肃省省教育厅计建处、省政协教科文委专家组和省高等职业学校设置专家评估组先后就设置敦煌职业高等技术学院的基建规划、基本办学条件等情况进行了考查论证。
2001年6月28日，按《甘肃省人民政府关于同意建立酒泉职业技术学院的批复》（甘政函[2001]89号）精神，撤销酒泉教育学院和酒泉地区工业学校建制，在两校基础上建立酒泉职业技术学院，实施高等职业教育，并继续承担原酒泉教育学院师范类培养、培训职能。同年9月，学院开办汉语言文学、计算机与信息管理、财会、财务税收、计算机应用技术、英语教育等6个高职专业，其中计算机应用技术学制3年，其余2年。
2001年11月10日，经甘教高发[2001]51号文件批准，新增计算机教育、多媒体与网络技术、旅游英语（导游方向）、广告策划与现代文秘、工程技术与造价、工业与民用建筑等6个高职专业，旅游英语（导游方向）、广告策划与现代文秘学制2年，其余3年。
2001年11月19日，教育部教发函〔2001〕248号文件同意对学院予以备案。
2001年12月29日，经甘教高[2001]58号文件批准，学院新增旅游英语、电子商务、工业与民用建筑、工商管理、市场营销等5个成人专科专业，其中工业与民用建筑学制3年，其余2年。
2002年，酒泉市委、市政府决定全面整合大中专教育资源，以酒泉职业技术学院为龙头在酒泉市高新技术工业园区建设职教园区。同年5月9日，行署常务会议决定将原酒泉天宏糖业有限责任公司不属于破产的总计500万元资产和公共绿化一次性划拨学院，用于发展地方高职教育。
2002年6月，两校完成实质性融合，酒泉职业技术学院正式成立。学院在南、北两个校区同时办学，原酒泉教育学院为北校区，原酒泉地区工业学校为南校区。
2002年6月28日，学院设置下属机构26个，其中：党委职能部门3个，包括：党委办公室、工会、团委；行政职能部门10，包括：院长办公室、人事处、学生处、教务处、总务处、基建处、校产处、继续教育处、毕业生就业指导中心；教辅部门3个，包括：图书馆、学报编辑部、教学设备管理处；教学部门10个，包括：教育科学研究所、外语系、汉语言文学系、计算机应用工程系、数学系、经济系、工业民用建筑工程系、公共课教学部、艺术系、生物化学应用工程系。
2002年9月，除英语教育、汉语言文学外，各高职专业开始举办五年一贯制教育。
2002年11月，育才学校经行署研究划归酒泉职业技术学院管理，对外仍保持其原有法人资格和办学主体。
2002年12月9日，经甘教高发[2002]53号文件批准，新增商务英语、工程监理、电子商务等3个高职专业，学制3年。
2003年1月，市政府在兰州召开敦煌大学规划设计方案招标会，甘肃省建筑设计研究院中标，由此，学院新校区建设规划基本确定；4月，新校区奠基，一期工程开工建设。
2003年5月1日，按《酒泉市人民政府关于酒泉职业中专上划分割方案的批复》（酒政发[2008]81号）精神，酒泉职业中专上划分割酒泉职业中专分割上划酒泉职业技术学院，原酒泉职业中等学校（酒泉职业中学）牌子同时归属学院。5月14日，在此基础上设立中专部，主要负责各类中专招生、教学、教务等管理工作。
2003年6月，根据酒政发[2003]98号文件精神，酒泉农林科技学校、酒泉市财经学校、酒泉市卫生学校等3所中专学校分别加挂酒泉职业技术学院农林科技分院、财经分院和医学分院牌子。
2003年7月，学院顺利通过甘肃省省教育厅组织的教学质量合格评估，被评为甘肃省同年设置的七所高职院校中发展态势最好的院校之一。
2003年12月10日，按酒泉市人民政府《关于酒泉市财经学校划归酒泉职业技术学院管理的批复》（酒政发[2003]222号）精神，酒泉市财经学校划归学院管理，实行一套班子、统一财务、统一管理的体制，对外继续保留酒泉市财经学校的牌子。
2003年12月12日，市政府决定将市委党校与学院北校区进行整体置换，学院北校区划转党校作为新校址，原党校校址划转学院组织成人教育和继续教育。
2003年，经甘教高发[2003]67号文件批准，新增作物生产技术、畜牧兽医、机电一体化、图文信息技术、艺术教育（音乐方向）、艺术教育（美术方向）等6个高职专业，学制3年。12月23日，经甘教高发[2003]72号文件批准，新增交通管理、艺术教育等2个成人专科专业，学制分别为2年、3年。
2004年3月，学院进行了机构调整，党政机构设党委办公室、组织人事处、团委、院长办公室、教务处、招生办公室、教育科学研究所、计财处、总务处、图书馆；教育教学机构设公共教学部、理工部、成人教育部、中专部，其中中专部兼挂酒泉职业中等学校牌子，成教部兼挂酒泉电大分校牌子。同期，完成了与中心粮库、良信公司等的土地置换。
2004年6月，学院获得职业技能鉴定资格，加挂“酒泉市第六国家职业技能鉴定所”牌子，开始承担焊工、电器产品维修、汽车维修、维修电工、计算机操作员、烹调、客房服务员、餐厅服务员等8个工种的初、中级职业技能鉴定工作。
2004年7月，根据酒泉市人民政府《关于酒泉农林科技学校整体并入酒泉职业技术学院的批复》（酒政发[2004]22号）精神，学院开始整合农校资源；9月，农校并入，对外仍保留农校牌子；10月27日，改组为酒泉职业技术学院农林教学部，下设农学系、园林园艺系、畜牧兽医系，使系的数量达到12个。
2004年8月，按酒市文发[2004]40号《关于举办艺术表演、群众文化专业班的通知》精神，学院开办小学起点艺术表演专业，学制5年。同年，经甘教高[2004]61号文件批准，学院增设园艺技术、电子信息工程技术（筹建）、水利水电工程管理（筹建）等3个高职专业，学制3年。
2004年9月底，除农林分院、礼堂以外的所有在建项目全部竣工并投入使用，完成建筑面积40057平方米，铺油面40038平方米，硬化地面62226平方米，绿化面积9000平方米，安装水暖管道6215米，架设围墙围栏1500米；10月13日，学院完成整体搬迁。
2004年底，学院取得聘请外国文教专家（外籍教师）单位资格。
同年，学院联系就业岗位283个，与50多家单位签订了用人意向协议书，有80人通过毕业生就业指导中心与用人单位签订了就业合同，另有6人通过专升本考试被甘肃省内高校录取，当年年底就业率达到78%。
2005年1月，酒泉市财经学校并入，对外仍保留财校牌子；2月，改组为酒泉职业技术学院财经部。至此，院校资源整合基本完成。当年，学院固定资产达1.24亿元，校舍面积突破11万平方米。
2005年4月7日，经甘教高发[2005]20号文件批准，新增畜牧兽医、水利工程、园林技术等3个成人专科全脱产专业，学制3年。4月22日，经甘教高[2005]12号文件批准，正式设置电子信息工程技术、水利水电工程管理等2个高职专业。
同年，经省教育厅核准，可开办现代教育技术、计算机多媒体技术、计算机网络技术、旅游英语、技术设计、文秘、工程造价、建筑工程技术、商务英语、工程监理、电子商务、作物生产技术、畜牧兽医、机电一体化、图文信息技术、音乐教育、美术教育、语文教育、汉语、计算机与信息管理、会计、财务信息管理、税收、财政、计算机应用技术、英语教育、园艺技术、电子信息工程技术、水利水电工程管理等29个高职专业。
2005年4月，学院农林教学楼开工。7月，多功能礼堂竣工并投入使用，同期，经教育部港澳台事务办公室批准，农林教学楼项目受赠邵逸夫教育基金300万港元，更名为逸夫教学楼，成为甘肃省唯一列入第十九批邵逸夫先生赠款的高校项目。
2005年9月，学院通过中国民主同盟聘请了Tim Robinson 和Sandi Robinson二名美籍教师，主要担任学院旅游管理系英语类专业的口语教学。
2005年9月15日，经甘教字[2005]60号文件批准，学院开始自主举办计算机类、工程管理类、电子信息类、农业技术类、财务会计类、语言文化类等6个高职高专教育专业类。
2005年9月27日，学院决定以资源重组为突破口调整内设机构，撤销原由整合前以学校为基础设立的6个教学部及12个系，成立旅游管理系、建筑工程系、生物工程系、经济管理系、机械工程系等5个系和继续教育部、公共课教学部等2个部。
2005年10月16日，甘肃省高职高专研究会2005年年会在学院召开。会议由甘肃省高职高专研究会副会长、兰州石化学院院长张方明主持。来自全省各高职高专院校的近40位与会代表聆听了会长于忠正所作的重要讲话，并就我省高职高专院校的生存与发展问题展开了热烈讨论。酒泉市副市长安邕江出席会议并致辞。
2005年11月2日，经甘教字[2005]69号文件批准，增设石油化工生产技术、建筑设计技术、园林工程技术、机械制造与自动化、汽车检测与维修技术、旅游管理等6个高职专业，学制3年。至此，学院科开办高职专业达到35个。
2005年12月8日下午，学院2006年毕业生就业洽谈会隆重召开，来自省内外的40多家用人单位参加了此次“双选会”，提供岗位570余个，用人单位提供的就业岗位与毕业生之比达到1:1。
2005年12月20日至21日，酒泉职业技术学院对64名校内外人员首次进行了焊工、电器产品维修、汽车维修、维修电工、计算机操作员等5个工种的中级职业资格鉴定。
2005年底，学院组织申报的初等教育（学前教育）专业初步通过了省教育厅专家组的评估验收，涉及学前教育、英语教育、音乐教育、美术教育、现代教育技术、中文与社会教育等6个高职专业。
2006年1月，学院进一步调整内设机构，成立了办公室、组织人事处、教务处、团委（学生处）、招生就业办公室、计财处、总务处等7个党政部门，教育科学研究所、图书馆等2个教辅部门，以及旅游管理系、建筑工程系、生物工程系、经济管理系、机械工程系、继续教育部、公共课教学部、中专教学部等8个教育教学部门。
2006年2月，酒泉职业技术学院被酒泉市人民政府命名为“绿色培训基地”，开始承担农村劳动力转移培训任务。
2006年3月15日上午，学院逸夫教学楼奠基仪式隆重举行，副市长安邕江同志参加奠基仪式并作了简短致辞。3月底，学院先后被肃州区人民政府、酒泉市绿化委员会分别授予“2005年度庭院绿化达标单位”、“酒泉市绿化模范单位”两项荣誉称号。
电子商务培养从事计算机网络技术和软件设计开发应用及电子商务技术方面的专门人才。主要课程有国际贸易实务、市场营销、商务交流、市场信息学、电子商务概论等。
会计学科培养能胜任各类中小企业、事业单位、咨询机构等单位财务信息管理的专业技术人员。主要课程有会计实务、基础会计、成本会计、财务管理、管理会计、西方会计、计算机应用基础、会计电算化、审计学原理、经济法等。
英语教育学科培养具有较出色的口头交际能力和一定的英语写作能力，能熟练地运用英语进行交际并从事英语教学管理工作的专业人员。主要课程有综合英语、英语口语、英语阅读、英语听力、英语写作基础、英语国家概况、英语语法、英语语音、英语教学法等。
旅游英语学科培养具备较出色的听说能力，能熟练的运用英语进行交际，掌握现代办公手段，能在外事、旅游等企事业单位从事管理，服务接待等工作的人员。主要课程有旅游心理学、中国旅游地理、中国旅游历史、综合英语、听力、口语、英语阅读、日语基础、旅游学概论、导游技巧与实务等。
旅游管理学科培养能在各级旅游行政管理部门、旅游风景（度假）区、旅行社及旅游宾馆等从事旅游管理工作的人员。主要课程有旅游学概论、中国旅游地理、世界旅游地理、旅游法学、旅游景点讲解、导游业务与中国导游、历史与宗教文化、旅行社与酒店经营管理、旅游美学、旅游度假区经营与管理、旅游资源评估与开发、旅游项目策划、计算机应用、大学语文、大学英语、旅游英语口语等。
建筑工程技术学科培养具备建筑工程师基本素质，能从事建筑工程生产一线技术与管理工作的人员。主要课程有建筑材料、建筑制图、建筑力学、建筑结构、地基与基础、建筑施工技术、房屋建筑学、建筑工程测量、建筑施工组织、高层建筑施工、建筑工程计量与计价、工程项目招标与合同管理等。
建筑设计技术学科培养具有独立进行建筑设计和用运多种方式表达设计意图，具有计算机文字、图形处理的能力，毕业后可在建筑设计部门、建筑装饰公司和园林规划设计部门从事建筑设计、室内装饰与设计、园林规划设计等技术的人员。主要课程有通过建筑设计、建筑构造、美术建筑制图、中外建筑史、居住区规划设计、室内设计、园林规划设计、建筑CAD（计算机辅助建筑设计）等。
水利水电工程管理学科培养具备制图、设计、工程测量、施工、组织管理等基本技能，能从事水利水电工程和其它土木工程的设计、施工组织管理等工作的人员。主要课程有水利工程制图、工程力学、水利工程测量、工程地质与土力学、水力学、水资源学、水利工程经济、水工建筑物、水电站、水利工程施工、水工钢筋混凝土结构学、水利工程概预算与招投标等。
机电一体化技术学科培养能编制工程产品的机械加工工艺规程、具备解决生产第一线机械制造工程领域里的工艺技术等问题的能力，能在机电工程领域的企事业单位从事机电产品制造、电气控制系统设计、机电设备制造维护和管理工作的人员。主要课程有工程力学、高等数学、机械制图、电工学、电子技术、金属工艺学、金属切削机床、机械设计、单片机原理、液压传动、传感器及检测技术、机制工艺与设备、数控机床技术、机电一体化系统设计等。
机械制造与自动化学科培养能在机械工程领域的企事业单位从事机械产品制造及其工艺、工装设计、计算机辅助设计，能够进行设备改造、维护、调试和管理工作的人员。主要课程有机械制图、计算机语言、工程力学、机械设计、金属切削原理及刀具、电工电子技术、机械制造工艺及夹具设计、机床及数控机床、机床电气及PLC、CAD/CAM等。
石油化工生产技术学科培养能在石油化工、石油炼制、有机化工、医药化工、精细化工、高分子化工等相关企业及部门从事生产、技术、管理、营销和其它工作的人员。主要课程有化工制图、计算机应用基础、有机化学， 化工原理、分析化学，高分子化学，石油炼制工艺学、有机化工工艺学、高分子工艺学、化工设备、生产过程自动控制，石油加工生产工艺学，精细化工工艺学，企业管理、市场营销等。
计算机多媒体技术学科培养能熟练进行计算机多媒体软件设计和开发、交互式多媒体作品的设计与制作，能从事电子出版、教育软件开发、商业简报制作、平面广告设计及其它多媒体应用领域的媒体集成与系统设计工作的人员。主要课程有计算机导论、平面构成、立体构成、广告心理学、多媒体技术基础、Flash动画设计、Phtotshop平面设计、Premiere视频制作、3D Max三维制作、Authorware多媒体制作、After Effect效果处理、音频编辑与处理等。
园林工程技术学科培养能在城市建设、园林、林业、旅游部门、园林植物和花卉企业中从事风景区、森林公园、城镇各类园林绿地的规划、设计、施工、园林植物繁育栽培、养护及管理的高等技术技能型专门人才 。主要课程有园林制图、 3DMAX、AUTOCAD、园林设计初步、园林规划设计、园林工程学、园林工程施工定额与概预算编制等。
作物生产技术学科培养具有种子繁育、生产、加工、营销的专业技术知识和操作技能，面向农业企事业单位、生产经营服务体系一线从事相关工作的人员。主要课程有植物及植物生理、作物栽培、种子学、良种繁育、种子贮藏加工与检验、作物病虫害防治与种子检疫、蔬菜栽培与制种等。
计算机应用技术学科培养能从事计算机系统、设备及网络安装、使用、管理及维护工作，计算机操作、文字处理、信息管理工作、新产品新技术设计、开发及售后服务工作的高级技术型应用人才。
电子信息工程技术学科培养具有电子技术和信息系统的基础知识，能采用先进的手段从事各类电子设备和信息系统的研究、设计、制造、应用和开发的技术人才。
音乐、美术教育学科培养德智体全面发展，适应中小学音乐和美术教育改革发展需要，具有扎实的音乐、美术教育基本理论和技能的高素质的中小学音乐、美术教师。
艺术设计学科培养掌握平面设计或室内外装饰和装潢设计的专业知识，具有较强技能，能在社会各设计部门从事美术设计与装饰工作的技术人才。
畜牧兽医学科培养熟练掌握兽医临床诊断的基本方法和程序的中高级技术人才。
园艺技术学科培养从事园艺植物栽培、良种繁殖、贮藏加工的生产管理、技术开发和推广的应用型高级技术人才。
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